ISSN 0374-647 X
BOL. A. N. DE MEDICINA 2002; 80(1):

INTERRELACIÓN ENTRE APOPTOSIS DEL MEGACARIOCITO Y
FORMACIÓN DE PLAQUETAS. RELEVANCIA CLINICA*

DRES. MARÍA ÁNGELA LAZZARI, ROBERTO GABRIEL POZNER,
SOLEDAD NEGROTTO Y MIRTA ANA SCHATTNER**

Presentado por la Académica Christiane Dosne Pasqualini

RESUMEN

En 1994 se caracterizó a la trombopoyetina como el principal regulador fisiológico del desarrollo megacariocítico y de la producción de plaquetas. A pesar de los importantes avances alcanzados en el conocimiento de los distintos pasos involucrados en la megacariocitopoyesis, el mecanismo molecular de la liberación de plaquetas a partir de megacariocitos maduros aún no está esclarecido. Una hipótesis es que la muerte celular o apoptosis del megacariocito sería el fenómeno que relaciona ambos eventos.
El proceso de apoptosis está regulado por varias familias de proteínas: los receptores de muerte, las caspasas y la familia de proteínas Bcl-2.
Recientemente se ha demostrado que en modelos de cultivo, entre los días 17 y 18, aproximadamente 50% de los megacariocitos presentan características de apoptosis y un aumento significativo del número de plaquetas.
La proteína antiapoptótica Bcl-xl (miembro de la familia Bcl-2) sería necesaria para mantener la sobrevida de MCs en desarrollo y se liberaría con las plaquetas recién formadas permitiendo a los megacariocitos senescentes sufrir apoptosis y ser eliminados por los monocitos/macrófagos.
La apoptosis de megacariocitos inmaduros que aún no son capaces de formar plaquetas sería la causa de la trombocitopenia observada en algunas patologías como síndrome mielodisplásico, trombocitopenia de radio y pacientes seropositivos para HIV.

Palabras Clave: Apoptosis, megacariocitos, plaquetas, trombocitopenia.

INTERRELATION BETWEEN MEGAKARYOCYTE APOPTOSIS
AND PLATELET FORMATION

In 1994, thrombopoietin was characterized as the main physiological regulator of megakaryocyte development and platelet production. In spite of the important advances in the different steps involved in megakaryocytopoiesis, the molecular mechanism of platelet release from mature megakaryocytes is not yet clarified. One hypothesis is that programmed cell death or megakaryocytes apoptosis would be the phenomenon relating both events. Several families of proteins regulate the apoptosis process: death receptors, caspases and the Bcl-2 family proteins.
It was demonstrated that in cell culture models, between days 17 and 18, approximately 50% of megakaryocytes show apoptotic features and a significant increase of platelet number.
The antiapoptotic protein Bcl-xl (member of the Bcl-2 family), seems to be necessary for the survival of developing megakaryocytes and it would be released within platelets to allow senescent megakaryocytes to undergo apoptosis.
Apoptosis of immature megakaryocytes that are not able to produce platelets would be the cause of thrombocytopenia observed in some pathologies like myelodisplasic syndrome, absent radii syndrome and HIV seropositive patient.

Key words: Apoptosis, megakaryocytes, platelets, thrombocytopenia.

La megacariocitopoyesis (MCp) comienza con células madres indiferenciadas que en respuesta a señales generadas por citoquinas o factores de crecimiento específicos evolucionan hacia el linaje megacariocítico. Estos cambios incluyen proliferación, endomitosis, maduración y fragmentación del citoplasma para dar lugar a la formación de plaquetas.
Durante muchos años el proceso de MCp fue poco conocido debido a que no se conocía el factor de crecimiento específico de megacariocitos (MCs).
En 1994, cinco grupos de investigación caracterizaron a la trombopoyetina (TPO) como el principal regulador fisiológico del desarrollo megacariocítico y de la producción de plaquetas. La TPO se produce de manera constitutiva en hígado y riñón y es liberada a la circulación. Tanto las plaquetas como los MCs expresan el receptor para la TPO que se conoce como c-mpl o CD110. Una vez que la TPO se une al c-mpl plaquetario es internalizada y luego destruida junto con las plaquetas por el sistema monocito-macrófago. En el transcurso de una trombocitopenia aguda, la TPO no tiene tanta masa de receptores disponibles resultando en una alta concentración plasmática que estimula la médula hipoplásica. Por el contrario, durante la trombocitosis el gran número de plaquetas remueve la mayoría de la TPO circulante dando como resultado una menor cantidad de TPO en la médula ósea (MO) que tiene poco efecto en los numerosos MCs retornando así a un estado estacionario en la producción de plaquetas1.
Los efectos biológicos más importantes de la TPO in-vitro incluyen: aumento del tamaño y número de colonias MCs, estimulación de la expresión de marcadores específicos de plaquetas como la GP IIb (CD41) y la GP IIIa (CD61) y estimulación de la endomitosis2. Si bien se demostró su papel esencial para la completa maduración del MC, su importancia como mediador de la liberación de plaquetas todavía es controvertida. Más aún, a pesar de los importantes y numerosos avances que se han realizado sobre la MCp desde el clonado de la TPO, el mecanismo molecular de la liberación de plaquetas a partir de MCs maduros aún no está esclarecido. Una hipótesis que cada vez tiene más aceptación es que la muerte celular del MC o apoptosis sería el fenómeno que relaciona ambos eventos.
La apoptosis es un proceso programado de muerte celular, una estrategia fisiológica común que las células utilizan para el desarrollo y la morfogénesis para controlar el número de células y eliminar aquellas que están dañadas, infectadas o senescentes.
Las células apoptóticas se reconocen fácilmente por características comunes tales como fragmentación del DNA, condensación de la cromatina nuclear, vacuolización citoplasmática, liberación de citocromo c mitocondrial, activación de caspasas citosólicas y externalización de fosfatidilserina sobre la membrana3.
La apoptosis es inducida frecuentemente por señales extracelulares (como exposición a estímulos de muerte o deprivación de factores de supervivencia), sin embargo algunas células altamente diferenciadas pueden activar un mecanismo de apoptosis constitutiva sin ninguna señal extracelular conocida.
El proceso de apoptosis está regulado por varias proteínas. Entre ellas encontramos la familia de los receptores de muerte4, las caspasas5 y una familia de proteínas conocidas como Bcl-26. Los receptores de muerte se encuentran en la superficie celular y transmiten señales apoptóticas iniciadas por ligandos específicos. Estos receptores pertenecen a la superfamilia de los genes del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) dentro de la cual se encuentran el CD95, también llamado Fas, el TNFR1 y los TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) DR4 y DR5.
La familia de caspasas está compuesta en humanos por 12 enzimas. En respuesta a una señal apoptótica, las caspasas iniciadoras como 8, 9 o 10 son autoclivadas dando como producto 2 isoformas activas, que clivan otras procaspasas, hasta la activación de las proteínas efectoras como caspasa 3 y 7, responsables de la apoptosis ya que sus sustratos generalmente son proteínas del citoesqueleto.
Las Bcl-2 son un grupo de 15 enzimas. Los miembros de esta familia pueden ser subdivididos en dos grupos según su función: 5 miembros son antiapoptóticos y 10 son proapoptóticos. Cada miembro ejerce su función anti o proapoptótica a través de homo o heterodimerización con otros miembros. Proteínas de esta familia son ampliamente expresadas en diferentes tipos celulares hematopoyéticos y son necesarios para gobernar la viabilidad de los progenitores. Bcl-2 y Bcl-X cumplen un rol antiapoptótico evitando la liberación de citocromo c de la mitocondria y manteniendo la integridad de la organela. Bad y Bax son proapoptóticas ya que facilitan la formación de poros y la liberación de citocromo c6. Un determinante importante para establecer si una célula sufrirá apoptosis es el balance intracelular entre ambas.
Dado que los MCs en la médula ósea son muy raros (0.02-0.05% del total de células nucleadas) y como la fagocitosis de células muertas es muy efectiva, casi todo el análisis de apoptosis de MCs se ha realizado en líneas megacariocíticas o en MCs derivados in-vitro del cultivo de células indiferenciadas, CD34+.
Los primeros estudios sobre apoptosis de MCs fueron realizados por Zauli y col.7. Ellos observaron que células CD34+ cultivadas en presencia de TPO durante 10-12 días proliferaron y maduraron. A los 15 días ya no se detectó proliferación y del total de células, aproximadamente un 50% eran grandes y poliploides (8 y 16n) mientras que el resto tenían un contenido de ADN igual a 2 o 4 n. A partir del día 15 se observó una disminución en el porcentaje de células viables. En los días 17 y 18 muchos MCs presentaron por microscopia electrónica características de apoptosis como pérdida del citoplasma y núcleos densos rodeados de citoplasma granular que eran similares a los núcleos desnudos observados ocasionalmente en biopsias de médulas normales. Análisis cuantitativos mostraron un aumento progresivo de células apoptóticas llegando a un 50% el día 18. Las células apoptóticas eran principalmente MC hiperploides y de gran tamaño, es decir que el MC maduro sufría apoptosis aun con suficiente TPO. Cuando cultivaron MCs primarios aislados de la MO en presencia de TPO sola o combinada con otras citoquinas observaron que al día 6 nuevamente 50% de los MCs tenían signos de apoptosis. El hallazgo más novedoso de este trabajo fue que asociaron la cinética de producción de plaquetas con muerte celular y demostraron que la misma estaba relacionada de manera inversa a la de los MCs, es decir, si bien al principio del cultivo casi no había plaquetas, la presencia de las mismas era máxima entre los días 18 y 21.
La conclusión de estas observaciones fue que el destino final de los MCs es la muerte por apoptosis. Asimismo especularon que la apoptosis del MC estaría relacionada con la generación de plaquetas.
En trabajos siguientes se demostró la presencia y regulación de la proteína antiapoptótica Bcl-xl durante la diferenciación de las CD34+ 8. Se observó que la expresión de Bcl-xl aumenta durante los primeros 15 días de cultivo de células CD34+ con TPO pero en el día 20 es drásticamente reducida siendo el perfil de expresión acompañado por la presencia de apoptosis. Consistentemente con el patrón de expresión de Bcl-xl y el inicio de apoptosis fue la observación que en el día 17-18 muchos de los MCs habían perdido su citoplasma y aparecían como MCs senescentes apoptóticos. Análisis de inmunocitoquímica mostraron que mientras en el promegacariocito la expresión de Bcl-xl es débil, en el hiperploide se ve muy aumentada, en el senescente es casi no detectable y en las proplaquetas la expresión de Bcl-xl es alta. De esta manera, la expresión de Bcl-xl sería relevante para la sobrevida del MC en desarrollo y se liberaría dentro de las plaquetas para permitir a los MCs senescentes sufrir apoptosis. Las señales de apoptosis en el MC senescente permitirían que éste sea eliminado por los monocitos/macrófagos. Si bien la relevancia de estos hallazgos in-vivo aún no ha sido evaluada, es importante señalar que plaquetas obtenidas de sangre periférica expresan grandes cantidades de Bcl-xl8.
En individuos sanos, la detección de MCs apoptóticos es dificultosa. Sin embargo, en situaciones patológicas se ha demostrado que algunos desórdenes trombocitopénicos están asociados a una apoptosis prematura de los MCs en la médula. Por ejemplo, en pacientes VIH (+) se identificó un alto grado de MCs apoptóticos que se correlacionó inversamente con el recuento plaquetario9. Un fenómeno similar ocurre en enfermos con mielodisplasia donde se ha postulado que una apoptosis prematura sería la causa de la diferenciación anormal de los MCs así como también de la defectuosa hematopoyesis10. Tradicionalmente se describía a las mielodisplasias como enfermedades clonales caracterizadas por hematopoyesis inefectiva y citopenias periféricas. Hoy podrían definirse como enfermedades clonales con períodos de alta proliferación que provocan una hematopoyesis inefectiva y apoptosis que conduce hacia las citopenias periféricas. Estudios recientes demostraron que en pacientes con síndrome mielodisplásico uno de los mecanismos de apoptosis sería la activación de caspasas en células nucleadas de MO11. También se observó que en pacientes con trombocitopenia por ausencia de radio existe un bloqueo en la diferenciación de los megacariocitos inmaduros12.
La comprensión del mecanismo de apoptosis en los MCs permitiría desarrollar enfoques terapéuticos que mejoren la producción de plaquetas en enfermedades con hematopoyesis inefectiva.

BIBLIOGRAFÍA

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Trabajo presentado en la Sesión Pública Ordinaria de la Academia Nacional de Medicina el día 6 de mayo de 2002.
Dto. Hemostasia y Trombosis, Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex" (I.I.HEMA.), Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires.
Dción. Postal: Dra. María A. Lazzari. Pacheco de Melo Nº 3081, 1425-Buenos Aires, Argentina.
E-mail: mschattner@hematologia.anm.edu.ar