ISSN 0374-647 X
BOL. A. N. DE MEDICINA 2002; 80(1):
ROL DEL ÓXIDO
NÍTRICO EN LA APOPTOSIS DEL MEGACARIOCITO*
DRES. MIRTA ANA SCHATTNER, ROBERTO GABRIEL
POZNER,
SOLEDAD NEGROTTO Y MARÍA ANGELA LAZZARI**
Presentado por la Académica Christiane Dosne Pasqualini
RESUMEN
El óxido nítrico
es uno de los metabolitos más pequeños biológicamente
activo que regula distintos procesos fisiológicos y patofisiológicos
en el sistema cardiovascular, inmune y nervioso.
Hemos explorado recientemente su rol en la megacariocitopoyesis utilizando
como modelo in-vitro el cultivo líquido de células mononucleares
o de células indiferenciadas obtenidas a partir de médula
ósea humana y estimuladas con trombopoyetina.
Se observó que la generación de óxido nítrico
de manera exógena es capaz de inhibir el crecimiento de los megacariocitos
induciendo apoptosis tanto en células de estadíos inmaduros
como terminales por un mecanismo independiente de la guanilil ciclasa.
La exposición de los cultivos a la L-arginina (sustrato fisiológico)
o a una combinación de citoquinas proinflamatorias resultó
en una supresión del crecimiento de los megacariocitos junto
con un aumento significativo en los niveles de óxido nítrico.
La presencia de inhibidores de la síntesis de óxido nítrico
bloqueó su producción y revirtió parcialmente la
inhibición del crecimiento de los megacariocitos.
Nuestros resultados constituyen la primera evidencia de que el óxido
nítrico inhibe el crecimiento de megacariocitos por inducción
de apoptosis. Este hallazgo presenta nuevas perspectivas para comprender
los fenómenos involucrados en la megacariocitopoyesis y en la
formación de plaquetas.
Palabras clave: Apoptosis,
megacariocitos, óxido nítrico, plaquetas.
NITRIC OXIDE ROLE IN MEGAKARYOCYTE APOPTOSIS
Nitric oxide is a biologically
active metabolite that regulates many physiological and pathophysiological
processes in the cardiovascular, immune and nervous system.
We have recently examinated its role on megakaryocytopoiesis using pluripotent
or mononuclear cell liquid cultures from human bone marrow stimulated
by thrombopoietin.
Exogenously generated nitric oxide was able to inhibit megakaryocyte
growth by inducing apoptosis in both immature or terminal cells through
a guanylyl cyclase independent mechanism. Cell culture exposure to L-arginine
(physiologic sustrate) or to a proinflammatory cytokine cocktail resulted
in a megakaryocyte growth suppression together with an augmented nitric
oxide level. The presence of nitric oxide synthesis inhibitors blocked
its production and partially reverted inhibited-megakaryocyte growth.
Our results are the first evidence that nitric oxide inhibits megakaryocyte
growth by apoptosis induction. This finding presents new perspectives
to understand the phenomena involved in the megakaryocytopoiesis and
platelet formation.
Key words: Apoptosis, megakaryocytes,
nitric oxide, platelets.
El óxido nítrico (ON) es uno de los metabolitos biológicamente
activos más pequeños que actúa como regulador de
distintos procesos fisiológicos y patofisiológicos en
el sistema cardiovascular, inmune y nervioso. Es sintetizado a partir
de L-arginina por una familia de isoenzimas conocidas como óxido
nítrico sintasa (NOS). El ON puede ser producido en diferentes
tipos celulares de dos maneras: una constitutiva que genera pequeñas
cantidades responsables de varias funciones fisiológicas (regulación
del tono vascular, inhibición de la función plaquetaria
y liberación de neurotransmisores) y otra inducida que produce
altas concentraciones de ON transformándolo en una sustancia
con propiedades citotóxicas y citostáticas1.
El papel del ON en la regulación de la megacariocitopoyesis (MCp)
no ha sido investigado y teniendo en cuenta que la mayor parte de las
células que constituyen la médula ósea incluyendo
megacariocitos (MC) sintetizan y liberan ON, en este trabajo se analizó
el rol del ON en la proliferación de MCs inducida por trombopoyetina
(TPO)2.
Se utilizó como modelo in-vitro el cultivo líquido de
células mononucleares (CMN) o de células indiferenciadas
CD34+ obtenidas a partir de médula ósea humana y estimuladas
con TPO.
El recuento de células y el análisis por citometría
de flujo mostró que la presencia de dos dadores de ON químicamente
no relacionados como el nitroprusiato de sodio o el 2,2´-(hidroxonitrosohidrazino)bis-etanamina
(DETA/ON) en los cultivos de CMN produjo una significativa disminución
en el número de MCs de forma concentración-dependiente
(Figura 1A y B).
Para establecer si el ON tenía un efecto directo sobre los progenitores
hematopoyéticos o a través de las células accesorias
se evaluó el efecto del DETA/ON en cultivos de células
CD34+. La Figura 1C muestra que este dador de ON fue aún más
potente que en CMN.
A continuación nos interesó analizar si el efecto del
ON estaba asociado a un arresto en el ciclo celular o a un efecto citotóxico.
Entonces evaluamos, por incorporación de ioduro de propidio y
citometría de flujo, si el DETA/ON inducía apoptosis.
La Figura 2 muestra que las células en presencia de DETA/ON son
capaces de disminuir el contenido de ADN dando lugar a un aumento de
células en la población hipoploide.
En la Tabla 1 se observa que frente a un mismo tiempo de exposición
(24 horas) al ON las células maduras presentaron un 36% de apoptosis
mientras que en las células indiferenciadas el porcentaje fue
12%. Si bien esto podría sugerir que las células maduras
sean más susceptibles a la acción del ON, es importante
notar que los controles también tuvieron mayor porcentaje de
apoptosis muy probablemente asociada al hecho de que son células
terminales capaces de desencadenar una apoptosis constitutiva.
Dentro del mecanismo de acción del ON, el GMPc es el principal
blanco del ON en el sistema vascular. Sin embargo, también se
ha demostrado que el aumento de GMPc es la vía a través
de la cual el ON produce un aumento en la síntesis de DNA y en
la proliferación de células musculares lisas de rata así
como también en la migración y proliferación de
células endoteliales.
Para evaluar si este nucleótido cíclico formaba parte
del mecanismo de muerte celular, en los siguientes experimentos se utilizó
un análogo permeable del GMPc, el 8-Br-GMPc, el cual no afectó
de manera significativa el crecimiento y diferenciación de los
MCs en ninguna de las concentraciones utilizadas (Tabla 2). Esto indica
que la activación de la guanilil ciclasa no estaría involucrada
en la vía de transducción de señales relacionada
con la inhibición de la proliferación de MCs mediada por
ON.
El siguiente paso fue intentar establecer el rol del ON endógeno
y teniendo en cuenta que la L-arginina es el sustrato fisiológico
de las ON sintasas, se trataron cultivos de células CD34+ con
este aminoácido. La Figura 3 muestra que, en forma concentración-dependiente,
la presencia de L-arginina disminuyó significativamente el desarrollo
de MCs.
La inducción de la isoforma inducible de la NOS en diferentes
tipos celulares se logra por la estimulación con citoquinas proinflamatorias,
como TNF- e IFN- . En nuestros cultivos, la presencia de estas sustancias
generaron además de un aumento significativo en los niveles de
ON (valorado por la técnica de Griess), una marcada disminución
en el número de MCs. Bajo estas mismas condiciones de estimulación,
el pretratamiento con dos inhibidores de la síntesis endógena
de ON como NG-Monometil-L-arginina (L-NMMA) o NG-L-arginina-Metil Ester
(L-NAME) bloqueó la producción de ON y la inhibición
del crecimiento de los MCs se revirtió parcialmente (Figura 4).
En conjunto nuestros resultados arrojaron, por primera vez, claras evidencias
de que el ON inhibe el crecimiento de MCs inducido por TPO a través
de un efecto citotóxico directo tanto en células madres
y progenitoras como en MCs maduros y que la acción supresora
del crecimiento inducida por citoquinas es parcialmente mediada por
ON. Si bien es conocido que el ON induce apoptosis en otros tipos celulares,
incluyendo células hematopoyéticas, sus implicancias en
la MCp son de particular consideración teniendo en cuenta que
los MCs son células formadoras de plaquetas y el descubrimiento
de factores que influencien el desarrollo y maduración de plaquetas
pueden aportar nuevas claves asociadas a la producción plaquetaria.
La inducción de apoptosis de MCs mediada por ON fue simultáneamente
observada por el grupo de Loscalzo y col. utilizando líneas celulares
diferenciadas hacia MCs3. Ellos profundizaron en los mecanismos involucrados
y encontraron que mientras en células no tratadas hay una alta
expresión de Bcl-2 (proteína antiapoptótica) sin
expresión de la proapotótica Bax, el tratamiento con ON
de células Meg-01 induce una disminución de Bcl-2 y la
aparición de Bax.
En un segundo trabajo muestran que concomitantemente a la inducción
de apoptosis del MC, el tratamiento de las células Meg-01 con
un dador de ON o el cocultivo con fibroblastos estimulados con citoquinas
que inducen la producción de ON, dan como resultado la formación
de plaquetas funcionales4.
En conclusión, ambos trabajos confirman que la inducción
de ON produce apoptosis de precursores y de MCs maduros. Sin embargo
la formación de plaquetas asociada a la apoptosis mediada por
ON es un fenómeno que aún debe elucidarse en MCs primarios
o in-vivo.
Trabajo presentado en la
Sesión Pública Ordinaria de la Academia Nacional de Medicina
el día 6 de mayo de 2002.
** Dto. Hemostasia y Trombosis, Instituto de Investigaciones Hematológicas
"Mariano R. Castex" (I.I.HEMA.), Academia Nacional de Medicina
de Buenos Aires.
Dción. Postal: Dra. Mirta Schattner. Pacheco de Melo Nº
3081, 1425-Buenos Aires, Argentina.
E-mail: mschattner@hematologia.anm.edu.ar
BIBLIOGRAFÍA
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3. Battinelli E, Loscalzo J. Nitric oxide induces apoptosis in megakaryocytic
cell lines. Blood 2000; 95:3451-9.
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of platelet formation from megakaryocytoid cells by nitric oxide. Proc
Natl Acad Sci USA 2001; 98:14458-63.
Leyendas de figuras y tablas
Figura 1. Inhibición
del crecimiento de megacariocitos por dadores de óxido nítrico
en megacariocitos derivados de células mononucleares (A y B)
o de células CD 34 (C).
Figura 2. Determinación
de apoptosis por citometría de flujo. A: sin DETA/ON, B: DETA/ON
125 uM.
Figura 3. Inhibición
del crecimiento de megacariocitos por L-arginina.
Figura 4. Efecto de citoquinas
proinflamatorias sobre la proliferación de megacariocitos y la
producción de óxido nítrico en células mononucleares.
Tabla 1. Porcentaje de apoptosis
de células CD34 y células mononucleares inducida por DETA/NO.
Tabla 2. Efecto del 8-Br-GMPc
sobre el crecimiento de células mononucleares.